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從肝臟組織中制備細胞核

發布時間: 2022-09-14  點擊次數: 364次

一、材料與儀器:

大鼠、裂解緩沖液、濃蔗糖溶液、超速離心機、組織研磨器


二、實驗步驟:

1. 配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液(PMSF 在使用前添加),冰上放置。


裂解緩沖液:

① 0.25mol/L蔗糖網織紅細胞標準緩沖液(RSB)

② 0.25 mol/L 蔗糖(超級純)

③ 10mmol/Tris-HCl (pH7.4)

④ 10mmol/L NaCl

⑤ 3mmol/L MgCl2

⑥ 1mmol/L DTT

⑦ 0.5mmol/L PMSF (用前從溶于乙醇的100 mmol/L貯存液中添加)


濃蔗糖溶液:

①2mol/L蔗糖RSB

②2mol/L蔗糖(超級純)

③10mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

④10mmol/L NaCl

⑤3mmol/L MgCl2

⑥1mmol/L DTT

⑦0.5mmol/L PMSF(用前從溶于乙醇的100 mmol/L 貯存液中添加)



2. 超速離心機(Beckman 的與SW28轉頭兼容型)和轉頭預冷到4℃。

3. 將組織研磨器(55 ml 的研磨腔; Thomas C 型腔和鋸齒型 Teflon 研杵,3431-E25)。量筒和燒杯放到冰上。


4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盤。

5. 處死大鼠,取出肝臟,稱重。

6. 在一玻璃盤上,用剃刀片快速去除結締組織,將20g肝臟切成大約1cm3的小塊。

7. 將肝臟碎塊裝入含40 ml ( 兩倍體積)裂解緩沖液的冷的燒杯中。

8. 將大約30ml這種肝臟碎塊和緩沖液混合物倒入預冷的組織研磨器腔中。

9. 將研杵連到推進器,便其滑到研磨腔中,直到觸到緩沖液面。然后握住研磨腔側面,打開推進器。逐漸加大推進器速度直至其最高速度,同時穩定地將研磨腔沿轉動的研磨向上推進。當研杵到達研磨腔底部時,向下拉研磨腔直到所有勻漿都從研杵旁通過,然后再將研磨腔沿研杵推回。重復該過程5~10次后關掉推進器。

10. 檢查細胞的裂解效率:

(1) 將研磨腔放到冰上,取出10μl裂解液,用1ml裂解緩沖液稀釋。

(2) 2.7μl稀釋后的裂解液加到載玻片上,再加上2.7μl 10μg/ml Hoechst 染料(33258 10 mg/ml;Molecular Probes 或其他供應商)的裂解緩沖液,然后用一 18 mm2 1號蓋玻片將液滴蓋上。

(3) 比較亮的DNA染色的細胞核與同一視野的相圖。

(4) 如果裂解細胞數少于95%,加大推進器速度,繼續研磨樣品5~10次。

11. 在一漏斗中裝入4層粗孔濾紙,放到一埋在冰浴中的量筒中,然后將勻漿倒進漏斗。

12. 裂解剩余的肝臟碎塊,勻漿通過濾紙過濾與其余裂解物樣品混和,記錄得到的裂解物體積。

13. 將裂解物體積除以 6,再從離心管體積(35~38 ml) 中減去該體積。即可確定加入 6 個離心管中的濃蔗糖溶液的體積。在2mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至終濃度為0.5 mmol/Lol/L。取適當體積(通常為25~30 ml ) 加到離心管中,冰上放置。

14. 向離心管中加入濃蔗糖溶液和等體積裂解物(通常7~9ml )。加裂解物時,應將移液管頭靠在離心管內壁上部使裂解物緩慢流下,這樣可減少裂解物與蔗糖溶液的混和。

15. 將離心管放到預冷的轉桶中,對面的轉桶用裂解緩沖液平衡。

16. 轉桶在SW28 轉頭上裝好,放進預冷的離心機中,23000g,4℃離心30分鐘。

17. 吸出裂解物和蔗糖溶液,或者在一燒杯上將離心管倒轉將液體倒出。用一無絨紙巾清除內壁上的殘余物質,離心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解緩沖液重新懸浮沉淀。

18. 將沉淀的重懸浮液集中到一個50ml的離心管(錐形或圓形底)中,加裂解緩沖液至 50ml 終體積,在醫用離心管中1500g離心5分鐘。

19. 吸出上清,細胞核沉淀重懸浮于1 ml 的裂解緩沖液中。取出少量樣品稀釋100 倍后在血球計數板上計數細胞核數目。

20.用裂解緩沖液將樣品稀釋到期望濃度的兩倍,加入等體積甘油,放液氮中冷凍,-80℃保存。



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