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從哺乳動物細胞或組織分離DNA

發布時間: 2022-09-09  點擊次數: 626次

材料與儀器細胞、TBS抽提緩沖液、離心管

 

實驗步驟

步驟1根據樣品類型,從下列方法中選一個作為步驟1進行操作。

(1) 細胞樣品

① 單層培養的細胞

以用冰預冷的 TBS 將單層細胞洗滌2次,用刮棒把細胞刮入約0.5ml 的 TBS 中,將細胞懸液轉移到冰浴的離心管中,用1ml TBS沖洗培養皿,并入離心管中的細胞懸液。于 4℃ 以1500g離心10分鐘以收獲細胞。用5~10倍體積經冰預冷的 TBS 重懸細胞并再度離心。用TE ( pH 8.0)重懸細胞,使細胞密度為 5x107 細胞/ml,轉移至一個三角燒瓶中(1ml 細胞懸液用 50ml 燒瓶;2ml 則用100ml燒瓶;余類推)。每毫升細胞懸液加入10ml抽提緩沖液,在37℃孵育1小時,隨后進行步驟2。

 

抽提緩沖液:

10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0

0.1 mol/L EDTA,pH 8.0

20 ug/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

 

② 懸浮生長的細胞

4℃ 以 1500 g 離心 10 分鐘以收獲細胞。用與原培養液等體積的經過冰預冷的 TBS 重懸細胞,再次離心收獲細胞并重復洗滌步驟。用 pH 8.0 的 TE 重懸細胞使密度為 5x107 細胞/ml。將懸液轉移至大小適當的燒瓶中,依前聽述加入抽提緩沖液并孵育。

 

(2) 組織標本

將剛切制的組織碎塊放到盛有液氮的 Waring 絞切器的不銹鋼杯中,以最高速度絞切至組織粉碎成為粉末。待液氮蒸發,將組織碎末一點一點地加入到盛有近 10 倍體積抽提緩沖液(如前)的燒杯中。使粉末分散在抽提緩沖液的表面,面后振搖燒杯使粉末浸沒。待其*分散于溶液中后,將該溶液轉移至 50 ml 離心管中,37℃ 孵育 1 小時。隨后進行步驟 2。

 

(3) 血液標本

收集約 20 ml 新鮮血液,加入裝有 3.5 ml 酸性檸檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的試管中 。這一抗凝劑優于 EDTA,因為它在血液貯存過程中更能保存高分子量 DNA。這些血液在制備 DNA 前可于 0℃ 保存數天或于 -70℃ 長期保存。配制 ACD 時,混合:

檸檬酸0.48g

檸檬酸鈉1.32g

葡萄糖1.47g

加水至100 ml

用作抗凝劑時,每6ml新鮮血液中加入1ml ACD。

 

新鮮血液(20 ml):以 1300g離心15分鐘,棄上層血漿,用巴斯德吸管將淡黃層小心移到另一管中并再次離心。淡黃層即為密度不均一的白細胞寬帶。將經第二次離心的淡黃層重懸于15ml抽提緩沖液中,37℃孵育1小時,隨后進行步驟2。

 

凍藏血液(20 ml):在室溫水浴中融化,移至離心管中,用等體積 PBS 稀釋;隨后于室溫以 3500 g離心15分鐘并棄去上清液,其中含有已溶解的紅細胞用15ml抽提緩沖液重懸沉淀物;37℃孵育1小時,隨后進行步驟2。

 

步驟2蛋白酶K至終濃度為100ug/ml,用玻棒溫和地將酶混入黏稠的溶液中。

 

步驟3裂解細胞的懸液置于50℃ 水浴中3小時,不時懸動該黏稠溶液。

 

步驟4溶液冷卻至室溫,如有必要就將溶液倒入離心管。加等體積經 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)平衡的酚,緩慢地來回顛倒離心管 10 分鐘以輕輕地混合兩相 。如此時兩相未能混合形成乳濁液,則將離心管置于旋轉器上 1 小時,于室溫以 5000 g 離心 15 分鐘,使兩相分開。

 

步驟5大口徑移液管(出口直徑為 0.3 cm ) 將黏稠的水相移至一潔凈的離心管中并用酚重復抽提 2 次。

 

步驟6分離高分子量DNA(約200kb):第三次酚抽提后用全部水相于4℃對4L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液透析4次,直至透析液的 OD270 值小于0.05。讓透析袋留有使樣品體積增至1.5~2.0倍體積的空間。下轉步驟7。

 

分離大小為 100~150kb的 DNA:第三次酚抽提后,將全部水相移至另一離心管中并加0.2倍體積的 10mol/L 乙酸銨。在室溫下加 2 倍體積乙醇并轉動離心管使溶液充分混合。DNA立即形成沉淀,通??捎弥瞥?U 形并經封口的巴斯德吸管將沉淀從乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果DNA沉淀成為碎片,則在吊桶式轉頭中于室溫以 5000 g 離心 5 分鐘收集 DNA。用 70% 乙醇洗滌DNA沉淀2次,并按上述條件離心收集 DNA。盡可能*地除去70%乙醇,于室溫將DNA沉淀置于一個敞幵的管內,直至可見的痕量乙醇揮發殆盡。不要使DNA沉淀*干燥,否則極難溶解。

 

大約按每 5x106 細胞加 1ml TE (pH 8.0 )。將管子放在搖床平臺上慢慢搖動直至 DNA *溶解。這通常需要12~24小時。

 

步驟7測定 DNA 樣品在 260 nm 和 280 nm 處的光吸收。A260 與 A280 之比應大于 1.75。低于此值則表明制備物中留有大量蛋白質。在這種情況下,應加入 SDS 至終濃度為 0.5%,并重復步驟 2~7。

 

步驟8 計算 DNA 濃度,進行脈沖電場凝膠電泳或通過鋪在1%瓊脂糖支持層上的0.3%瓊脂糖凝膠電泳分析小量樣品。大于100kb的DNA,其遷移率應該比完整的噬菌體 DNA 的線性二聚體分子慢。將 DNA 貯存在4℃。

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