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細胞凍存和復蘇實驗

發布時間: 2022-09-01  點擊次數: 582次

實驗方法原理

       細胞凍存和復蘇的基本原理是慢凍快解凍,已被證明能最大限度地提高細胞活力。目前常用甘油或二甲基亞砜作為細胞低溫保存的保護劑。這兩種物質可以提高細胞膜對水的滲透性,再加上緩慢的冷凍可以使細胞內的水從細胞中滲出,減少細胞內冰晶的形成,從而減少冰晶形成對細胞的損傷。復蘇細胞時應采用快速熔融的方法,以保證細胞外晶體在短時間內熔融,以避免因水緩慢熔融進入細胞形成細胞內重結晶而對細胞造成損傷。


實驗材料:細胞


試劑、試劑盒:

       D-Hanks液 、小牛血清 、培養液、 青霉素、 鏈霉素、 胰蛋白酶、 HCl 、NaHCO3、 DMSO、 甘油


儀器、耗材:

微量加樣槍、吸頭、 離心管、 凍存管 、槍頭、 膠塞 、移液管玻璃瓶、 紅血球計數板、 記號筆、 醫用橡皮膏 、移液槍 、超凈工作臺 、離心機 、恒溫水浴箱、 冰箱、 倒置相差顯微鏡 、培養箱 、液氮冰箱


實驗步驟:

1、細胞凍存

①10%DMSO或甘油冷凍培養基的制備10~20%小牛血清。

② 對數生長期細胞用胰蛋白酶消化,懸液中生長的細胞直接移到15 ml離心管。

③離心機轉速1000轉,5分鐘。

④除去胰蛋白酶和舊培養基,加入適量配制好的冷凍培養基。用吸管輕輕吹氣使細胞均勻、計數,調整凍液中細胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml。

⑤細胞分成深低溫保存管,每管1~1.5ml。

⑥低溫保存管上標明細胞名稱、冷凍時間和操作人員。

⑦冷凍:標準的冷凍程序是冷卻速度為-1~-2°C/min。溫度低于-25℃時,可提高到-5°C~-10°C / min.。在-100℃時,可快速浸入液氮中。含有細胞的冷凍保存管也可以放在-20°C的冰箱里2個小時,然后放入-70°D的冰箱中過夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中。

2、細胞復蘇:

①將冷凍管從液氮容器中取出,直接浸入37°C溫水中,并不時搖晃,使其盡快融化。

②從37°C水浴中取出凍存管,打開蓋子,用移液器吸出細胞懸液,加入離心管滴下培養液10倍以上,攪拌均勻。       

③離心,1000轉/分鐘,5分鐘。

④棄去上清液,加入10%小牛血清培養基懸浮細胞,計數,調整細胞密度,接種培養瓶,37°C培養箱培養。

⑤第二天更換培養基,繼續培養。


注冊事項:

①從增殖期到形成致密單層細胞的培養細胞可用于低溫保存,但優選對數生長期細胞。冷凍前一天最好換培養基。

②將冷凍儲存管放入液氮容器或取出時,要做好防護工作,避免凍傷。。

③冷凍復蘇時,最好使用新配制的培養基。






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